Diplomarbeit von Frank Nils Penkert
Download der Diplomarbeit als PDF-Datei (450 kB)Der Einsatz von Lanthanidkomplexen als fluoreszierende Sonden hat großes Interesse auf sich gezogen, insbesondere als Alternative zu Nachweismethoden, die radioaktive Antikörper bzw. Liganden verwenden, sogenannnte Radioimmunoassays [1-3]. Diese Techniken sind weitverbreitet zur Detektion und Quantifizierung von wichtigen biologischen Molekülen, da sie eine sensitive Detektion ermöglichen. Fluoreszenz könnte eine genauso sensitive Detektion ermöglichen wie Radioaktivität, jedoch ohne die offensichtlichen Nachteile, die mit der Handhabung und Entsorgung von radioaktivem Material einhergehen. So wurden Nachweisgrenzen für Lanthanidfluoreszenz bei Konzentrationen von 10-12mol/l in wäßriger Lösung und von 2x10-15mol/l in ethanolischer Lösung berichtet [4-6]. Die Detektion von biologischen Makromolekülen kann bis in kleinere Konzentrationen erfolgen, da mehrere Chelate an ein Makromolekül gebunden werden können, ohne daß eine konzentrationsbedingte Fluoreszenzlöschung oder ein merklicher Verlust an biologischer Funktion auftritt [6-8].
Die Methode ist auch nicht nur auf Immunoassays begrenzt, sondern könnte auch der Detektion kleinerer Moleküle, wie z.B. einzelne DNA-Strängen, kleinere Peptide o.ä. dienen. Weitere Anwendungsmöglichkeiten bieten sich als Marker, um so gekennzeichnete Moleküle zu verfolgen, oder zur Entfernungsmessung im Bereich von ungefähr 5-10 nm mittels FRET-Messungen (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [9].
In jeder Anwendung, die mit Fluoreszenz in biologischen Medien arbeitet, ergibt sich das Problem, daß die biologische Probe selbst wahrscheinlich eine große Anzahl an fluoreszierenden Komponenten enthält. So fluoreszieren z.B. die aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan, sowie das reduzierte Nicotinamidadenin-dinucleotid (NADH). Durch diese Hintergrundfluoreszenz - auch Autofluoreszenz genannt - wird die Detektion erschwert und die Sensibilität erniedrigt. Weitere Probleme ergeben sich durch Streulicht und Ramanbanden, insbesondere wenn die Stokesverschiebungen klein sind.
Der Einsatz von Lanthanidkomplexen bietet potentiell eine elegante Lösung dieser Probleme. Die Hintergrundfluoreszenz von biologischem Material ist meistens bedeutend kurzlebiger im Vergleich zu den langen Lebensdauern, die bei Verwendung von Europium (Eu3+) und Terbium (Tb3+) beobachtet werden. Die Zeiten bei biologischem Material bewegen sich im Nanosekunden- bis Mikrosekundenbereich, während sie bei Eu3+ und Tb3+ bis zu einigen Millisekunden betragen können. Dies erlaubt eine zeitaufgelöste Detektion, in der zwischen Anregung und Messung der Fluoreszenz eine Wartezeit liegt. Bei der Fluoreszenzmessung ist die Hintergrundfluoreszenz schon abgeklungen, und auch das Streulicht kann keinen negativen Einfluß auf die Messung nehmen.
Im Prinzip könnte jedes Molekül mit hinreichend langer Phosphoreszenz ebenfalls in dieser Art und Weise genutzt werden. In den meisten Fällen jedoch erfordert das Beobachten von langlebiger Phosphoreszenz sauerstofffreie Lösungen und vielfach niedrige Temperaturen, um konkurrierende Deaktivierungsprozesse zu reduzieren, da ansonsten die Quantenausbeute sehr klein wird, und nur wenig Licht zur Detektion zur Verfügung steht.
Der Vorteil der Lanthanide liegt nun darin, daß bei geschickter Wahl des Komplexbildners die langlebige Fluoreszenz in wäßrigen, nicht entgasten Lösungen bei Raumtemperatur beobachtet werden kann. Weiterhin zeigen die Fluoreszenzspektren von Lanthaniden sehr schmale Signale, die bemerkenswert unempfindlich gegenüber Änderungen in der Umgebung sind. Die Wellenlänge verschiebt sich selten mehr als 2 nm, wenn die Temperatur oder sogar die koordinierten Liganden sich ändern. Eine schmalbandige Detektion wird ermöglicht, dadurch wird das Signalrauschverhältnis der Messung verbessert.